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His标签蛋白纯化试剂盒(超声裂解)图片
产品货号:
KD1340
中文名称:
His标签蛋白纯化试剂盒(超声裂解)
英文名称:
His-Tag Protein purification Kit I
产品规格:
10T
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价

本试剂盒是基于Ni亲和层析的蛋白质纯化方法进行His标签蛋白纯化的试剂盒;变性和非变性条件均可使用,也适用于纯化包涵体中的His标记蛋白。最大载量为20~30mg His标记蛋白质/mL介质。本试剂盒可满足10次His蛋白纯化(50mL体积的细菌)。




组分规格保存
Ni-Agarose介质(50%)5mL 2~8℃
洗涤液125mL
超声裂解缓冲液30mL
包涵体变性洗涤液125mL
1M咪唑溶液50mL RT
1M Tris-HCl溶液(pH7.9)30mL
5M NaCl溶液30mL
尿素15g
层析柱(6mL)10个
PMSF溶剂1mL
PMSF干粉100mg

保存:2~8℃,有效期1年,不可冻存!

实验准备:
第一次使用时把一管PMSF溶剂加入PMSF干粉中,震荡溶解,即配制成PMSF(10mg/mL)溶液。配成PMSF溶液后需-20℃保存。

操作步骤:

一、装柱
  • 将Ni-Agarose介质充分混匀后,取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中。
    注意:介质用量需要根据His蛋白产量决定,请根据实验需要取适量的Ni-Agarose介质加入层析柱。
  • 用5倍柱体积(指填料的体积,下同)自备去离子水洗柱,共三次。
  • 用5倍柱体积的洗涤液洗柱,共三次。
  • 室温5000g离心10min收集50mL表达菌液,弃上清,沉淀放冰上待用或放-80℃保存。最好用不加诱导物的菌液做对照。
    注意:以下成分均以50mL菌液计算用量,实际用量可根据菌体量增减。


二、裂解
超声破碎细菌:加入2.5mL冰浴的超声裂解缓冲液,再加入60μL PMSF(10mg/mL)溶液,冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索,但裂解物必须不粘稠,否则会堵塞层析柱。

三、纯化
  • 纯化可溶性His标记蛋白
    • 将上步得到的上清液上柱,用层析柱的底端的盖子盖上,让细菌裂解液和介质在4℃结合0.5-12h后取掉盖子,自然重力下让裂解液自然流出。
    • 用10倍柱体积洗涤液洗柱,收集并保存穿透液(含杂质或没被吸附的His标记蛋白,可做SDS-PAGE电泳的对照)。
    • 按下表配置含不同浓度咪唑的洗脱液,以确定His标签蛋白的最适洗涤液的咪唑浓度。按从低到高的顺序洗涤并收集样品,SDS-PAGE电泳检测His标记蛋白所在的区域。
      注意:建议咪唑浓度梯度为:40、70、100、200、300、400、500mM。
    • 如已知咪唑洗脱浓度,可直接配置该浓度的洗脱液进行洗脱。
    • 洗脱后,依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子,再用3倍柱体积的20%乙醇平衡(乙醇要将填料浸没),最后堵住层析柱下端的漏口,4℃保存待下次使用。
  • 纯化包涵体中His标记蛋白
    • 将包涵体沉淀重悬于2mL包涵体变性洗涤液。冰浴1h以使包涵体溶解,期间可轻柔摇晃几次。
    • 室温10000g离心20min,沉淀为未溶解的包涵体。将上清(含溶解后的His标记蛋白)以自备的针头过滤器(0.45μm)过滤。
    • 将滤过液上柱,用层析柱底端的盖子盖上,让细菌裂解液和介质在4℃结合0.5-12h后取掉盖子,自然重力下让裂解液自然流出。
    • 用10倍柱体积包涵体变性洗涤液洗柱,收集并保存穿透液(含杂质或没被吸附的His标记蛋白,可做SDS-PAGE电泳的对照)。
    • 按下表配置含不同浓度咪唑的变性洗脱液,以确定His标签蛋白的最适洗涤液的咪唑浓度。按从低到高的顺序洗涤并收集样品,SDS-PAGE电泳检测His标记蛋白所在的区域。
  • 纯化已复性的包涵体蛋白
    • 将可溶性蛋白溶液,按照纯化细胞裂解液中可溶性His标记蛋白操作。


四、再生(自备试剂)
纯化相同的蛋白质可以纯化5~7次后再进行再生,再生的凝胶最好用于相同蛋白的纯化。凝胶最多再生3~4次,一次或多次再生后,凝胶的蛋白结合能力会有所下降,并且非特异性结合也会升高。 具体步骤如下:
  • 5倍柱体积的去离子水洗柱一次。
  • 1倍柱体积的25%、50%、75%乙醇各洗柱一次。
  • 5倍柱体积的100%乙醇洗柱一次。
  • 1倍柱体积的75%、50%、25%乙醇各洗柱一次。
  • 2倍柱体积的去离子水洗柱一次。
  • 2倍柱体积的200mM EDTA (pH8.0),洗柱一次。
  • 5倍柱体积的去离子水洗柱一次。
  • 3倍柱体积的50mM NiSO4洗柱一次。
  • 3倍柱体积的非变性裂解液洗柱一次。
  • 加入3倍柱体积的去离子水洗柱一次。
  • 随后把凝胶存放在20%乙醇中,4℃保存。

相关搜索:His标签蛋白纯化试剂盒(超声裂解)His标签蛋白纯化试剂盒His融合蛋白纯化试剂盒His-Tag Protein purification Kit I
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